小羅開講 | 數字PCR之“分”而治之納米微孔對dPCR定量結果的影響

首先需要明確納米微孔的數量

是如何影響dPCR的定量結果。

dPCR采用直接計數的方法進行定量分析，即在PCR擴增結束后，將有熒光信號的納米微孔記為1，無熒光信號記為0（定量是二進制的，因此稱為“數字"）。有熒光信號的微孔說明至少含有一個拷貝的目標分子。在目標DNA濃度極低的情況下，理論上可以認為有熒光的納米微孔數目就等于DNA分子的拷貝數，但通常情況下，數字PCR的納米微孔中可能會包含兩個甚至更多的目標分子，因此需要采用泊松概率分布公式來進行計算：

λ = ?ln (1 ??p)

λ：每個微孔的目標分子的平均數量

p：具有正信號的納米微孔數量與微孔總數的比值。

可以使用λ計算出目標分子的絕對數量【2】，很明顯，微孔數越多，檢測的動態范圍就越廣【3】。

圖1的泊松概率分布曲線圖更直觀地體現了這一點：

如圖1顯示，隨著陽性微孔比例（p）的增加，體系中目標分子的平均拷貝數會有較大的差距，隨著p的持續增加，dPCR結果的不確定度也隨著提高。總體來說，dPCR陽性微孔數量不得超過總微孔數量的80%，總反應微孔數的增加提高的是dPCR檢測的線性范圍。

在傳統模擬分析中，測量的不確定度通常受檢測儀器分辨率的限制，例如，熒光檢測器分辨熒光信號微小差異的能力。但在dPCR 檢測中，檢測儀器只需要識別每個納米微孔是否有0個或大于1個目標分子，因此dPCR的數據分析較少依賴于檢測器的特性。排除了檢測器對dPCR定量結果的影響，那么下一個需要明確的信息是什么呢？

需要明確的是

引起dPCR偏差的來源有哪些。

dPCR主要有2個引起偏差的來源，分別是：二次采樣誤差和分區誤差。二次采樣過程引入了不可避免的誤差源，尤其是當原始樣本中要檢測的目標很少時，設定了檢測下限，儀器本身能兼容的二次采樣體積越大，一定程度上能提高檢測的靈敏度。

根據泊松分布原理，陽性微孔比例不超過80%，所以分區誤差在原始樣本濃度較高的情況下占主導地位。在一組重復實驗中，若信號為0的微孔數量存在差異，該差異會引起總反應體系中目標結果計算的差異。根據 Dube 等人的分析，可以找到對分區誤差的計算方式【4】【5】，根據該計算方式我們可以比較不同納米微孔數量下的分區誤差【6】。

圖2比較了20,000個微孔和1,000,000個微孔的二次采樣和分區誤差與樣本濃度的關系。在dPCR中，通常將每個納米微孔中的模板拷貝數λ的范圍調整到0.001到6【4】（在某些情況下，可以高達8【7】）。在納米微孔N為1,000,000時，分區錯誤顯著下降到<3%，說明微孔數量越多，越能降低分區誤差，從而提高dPCR的檢測準確度。

圖2 . ( A ) 20,000 個分區和 ( B ) 1,000,000個微孔的

二次采樣和分區誤差與樣本濃度的關系

（圖片來源：羅氏診斷整理）

由dPCR定量的原理分析得出，“分"成的納米微孔數量與定量結果的準確性和檢測范圍緊密相關，總結下來就是：微孔越多，dPCR結果越準確，動態范圍越廣。